华南师范大学环境研究院

环境浓度1,4-雄烯二酮(ADD)和雄烯二酮(AED)暴露对斑马鱼的跨代效应

马栋栋，蒋宇霞，张金阁，方贵桢，黄国勇，史文俊*，应光国*

近日，华南师范大学环境研究院应光国教授团队马栋栋博士和史文俊博士等人在Journal of Hazardous Materials上发表了题为“Transgenerational effects of androstadienedione and androstenedione at environmentally relevant concentrations in zebrafish (Danio rerio)”的研究论文(DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.127261)。该论文探究了环境浓度雄激素1,4-雄烯二酮(ADD)和雄烯二酮(AED)暴露对F0代和清水恢复144天F1代斑马鱼性别分化、性腺发育和基因转录表达的影响。研究结果表明：环境相关浓度ADD和AED具有雌激素效应，同时对斑马鱼的性别分化和转录表达具有跨代效应。

图文摘要   

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雄激素1,4-雄烯二酮(ADD)和雄烯二酮(AED)两种雄激素通常用于治疗人类和动物的卵巢功能障碍、乳腺癌和男性发育迟缓，并且在环境中大量检出。本研究探究了环境浓度ADD和AED对斑马鱼的跨代效应。受精后21 ~ 144天(dpf)的F0代斑马鱼暴露于环境浓度ADD和AED(0 ~ 500 ng/L)后，其F1代在清水中培养0 ~ 144 dpf。在F0代，ADD和AED均显著导致雌鱼增多，表现雌激素效应。在F1代，高浓度ADD组(393 ng/L)中雌鱼仍然显著多于雄鱼(63.5%)，而高浓度AED(428 ng/L)组中，雄鱼显著多于雌鱼(78.7%)。此外，ADD和AED对F0代和F1代雌鱼和雄鱼大脑昼夜节律的影响均相似。转录组测序及分析结果显示，不同浓度ADD和AED处理的F1代幼鱼中，神经毛细胞相关生物学过程(BPs)被富集。我们的研究结果表明：环境相关浓度ADD和AED对斑马鱼性别分化和基因转录表达均具有跨代效应。

引言

ADD和AED两种雄激素作为药物在人类和动物的疾病治疗中应用广泛。在污水处理厂进水中ADD(30 ~ 4650 ng/L)和AED(6 ~ 284 ng/L)的浓度通常比其他类固醇激素高1 ~ 3个数量级。在法国、日本、中国和美国的地表水中ADD和AED的浓度在0.1 ~ 548 ng/L之间，其检测频率接近100%。ADD和AED在水生生物体内也有一定程度的富集。研究表明，AED能够干扰鱼类内分泌系统，影响斑马鱼HPG轴相关基因的转录表达，并诱导食蚊鱼雄性化，表现出雄激素活性。有意思的是，AED可显著诱导斑马鱼卵黄蛋白原(VGT)水平升高，表现雌激素效应。我们前期野外研究表明，在富含雄激素水体中，同时发现了雌性化和雄性化的食蚊鱼。这些结果表明，AED可能同时具有雌激素和雄激素活性。在生物体内，ADD和AED均是合成雌激素的关键中间体。因此，ADD和AED可能对鱼类同时具有雌激素和雄激素效应。此外，越来越多的研究表明，斑马鱼亲代受内分泌干扰物刺激后能够影响子代的发育和生殖。ADD和AED作为环境中大量存在的雄激素物质，具有潜在的内分泌干扰效应，然而他们对鱼类子代的影响还不清晰。因此，本研究以斑马鱼为研究对象，利用环境浓度ADD和AED长期暴露探究其对鱼类的跨代效应。

图文导读

 Fig. 1. Effects of ADD and AED on sex differentiation and transcription of genes involved in sex differentiation in exposed F0 and indirectly exposed F1 generations. 

通过统计F0和F1代斑马鱼性别和分析性别分化相关基因表达，我们发现ADD可导致F0和F1代斑马鱼雌鱼比例均显著升高，并显著改变F0代斑马鱼cyp19a1a和dmrt1基因以及F1代斑马鱼cyp19a1a和cyp11b基因转录表达。AED暴露导致F0代雌鱼增多，中浓度AED诱导F1代雌鱼增多，而高浓度AED却导致F1代雄鱼增多。此外，AED诱导F0代斑马鱼cyp19a1a和dmrt1的转录表达显著上调，并且，AED显著上调F1代斑马鱼sox9a基因的转录表达，却显著下调cyp11b和cyp17a1基因的转录表达。

Fig. 2. Effects of ADD and AED on gonads in exposed F0 and indirectly exposed F1 generations.

通过统计F0和F1代斑马鱼性腺生殖细胞频率结果表明，ADD显著改变F0代斑马鱼卵巢核仁外周卵母细胞(PO)、皮质肺泡卵母细胞(PO)和早期卵黄卵母细胞(EV)的比例，并显著增加F1代精巢早期精子细胞(ES)的比例。AED显著改变F0代卵巢早期卵黄卵母细胞(EV)和F1代晚期卵黄卵母细胞(LV)的比例。

Fig. 3. Effects of ADD and AED on transcription of genes in circadian rhythm networks in the brain of exposed F0 and indirectly exposed F1 zebrafish.

通过分析F0和F1代斑马鱼大脑昼夜节律相关基因转录表达水平，发现ADD显著影响F0和F1代斑马鱼大脑昼夜节律相关基因clocka, arntl2, nfil3-5, per2, per1b, cry5, cry1ab, nr1d2b和tefa的转录表达，并且昼夜节律核心网络中的正调节因子(clock和arntl)和负调节因子(per和cry)之间符合负反馈调节关系。

Fig. 4. Venn diagrams analysis of the transcriptomics data in indirectly exposed F1 embryos

对F1代幼鱼进行转录组测序及分析结果显示，ADD处理组和AED处理组分别有362和285个重叠差异基因(DEGs)被富集，并且分别有23个和15个重叠生物学过程(BPs)被富集。同时，神经丘毛细胞发育和分化相关生物学过程在ADD和AED处理组中均被富集(Table 1)。

Table 1. The overlapping GOs in ADD and AED groups in F1 eleutheroembryos

结论

本研究结果表明，环境浓度1,4-雄烯二酮和雄烯二酮均具有雌激素效应，并对斑马鱼性别分化和昼夜节律基因转录表达的影响具有跨代效应。ADD和AED是水体中主要的雄激素物质，其浓度比其他类固醇激素高出1 ~ 3个数量级。综上所述，环境浓度ADD和AED对鱼类的影响可能会传递给未暴露的子代，并对水生生物种群动态平衡有潜在的影响。

参考文献：Dong-dong Ma, Yu-Xia Jiang, Jin-Ge Zhang, Gui-Zhen Fang, Guo-Yong Huang, Wen-Jun Shi, Guang-Guo Ying. Transgenerational effects of androstadienedione and androstenedione at environmentally relevant concentrations in zebrafish (Danio rerio), Journal of Hazardous Materials, 2022, 423:127261.

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